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1. 介紹

牛奶中的黃曲霉毒素 M1 被認(rèn)為是劇毒物質(zhì)，國(guó)際癌癥機(jī)構(gòu)將黃曲霉毒素M1列入一類致癌物清單中，歐盟規(guī)定其限量為0.05μg/kg。黃曲霉毒素M1可通過(guò)側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l進(jìn)行快速檢測(cè)，并通過(guò) ELISA 進(jìn)行定量，檢測(cè)時(shí)間至少為15分鐘和90分鐘。由于免疫層析技術(shù)中免疫化學(xué)的局限性，為實(shí)現(xiàn)歐盟限量中的高靈敏度造成了障礙。因此，ELISA 檢測(cè)方法仍然是黃曲霉毒素 M1 定量篩選最可靠的方法。

2. 研究目的

此研究的目的是對(duì)比一種創(chuàng)新的免疫層析檢測(cè)和 ELISA 方法對(duì)牛奶樣品中黃曲霉毒素M1的定量檢測(cè)能力。

3. 研究方法

指示型側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l由高親和力單克隆抗體、結(jié)合膠體金、一條化學(xué)修飾的半抗原測(cè)試線和一條抗體對(duì)照線組成?？裹S曲霉毒素 M1 使用正在申請(qǐng)專利的O.H.C.M.I.T 技術(shù)生產(chǎn)（半抗原載體摩爾濃度優(yōu)化型免疫原性技術(shù)）。在小鼠免疫接種和雜交瘤制備完成后，篩選克隆并使用蛋白 G 柱純化?；谶@些特異性抗體，創(chuàng)建了對(duì)稱型黃曲霉毒素M1側(cè)向?qū)游鰷y(cè)試產(chǎn)品（Symmetric M1），這款競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定產(chǎn)品，僅需10分鐘即可完成檢測(cè)，且樣品無(wú)需前處理。黃曲霉毒素M1的濃度由量化系統(tǒng) S-Flow 分析得出。S-Flow系統(tǒng)使用新型對(duì)稱量化技術(shù)，正在申請(qǐng)專利。掃描系統(tǒng)由 Lateral Logic有限公司提供。用于側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l測(cè)定的所有樣品（產(chǎn)品信息：Symmetric M1黃曲霉毒素檢測(cè)試紙條，S2196，批號(hào)S2196006，由 Prognosis Biotech S.A.股份有限公司提供）同時(shí)使用 ELISA 試劑盒進(jìn)行測(cè)定（產(chǎn)品信息：Bio-Shield M1 ES，B2096，批號(hào)B2096040，由Prognosis Biotech S.A. 股份有限公司提供）。

4. 研究結(jié)果

此研究中的 ELISA 試劑盒使用受控包被工藝，抗體具有穩(wěn)定的結(jié)合活性和較高特異性的特點(diǎn)，具有低基質(zhì)效應(yīng)和較優(yōu)的回收水平。在 2013-2017年多次奶或奶酪環(huán)測(cè)試（Ring Test）結(jié)果中，Z分?jǐn)?shù)的平均值為-0.0087（圖1）。

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圖1: 2013-2017 年度奶或奶酪環(huán)測(cè)試中 Z 分?jǐn)?shù)水平

在均質(zhì)牛奶（CHM），牛奶原奶（CRM），山羊奶原奶（GRM）和綿羊奶原奶（SRM）四種奶樣品中添加五種不同水平濃度的 AFM1（12.5、25、37.5、50、75ppt）作檢測(cè)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)每種奶樣品在 ELISA和側(cè)向?qū)游鰴z測(cè)中的回收率平均值幾乎相同。具體來(lái)看，ELISA檢測(cè)的平均回收率分別為97.6%、98.4%、102.5%和100.7%，側(cè)向?qū)游鰴z測(cè)分別為97.9%、97.5%、97.3%和 98.0%（圖2）。

圖2: ELISA和側(cè)向?qū)游鰧?duì)不同樣品中添加不同濃度黃曲霉毒素M1檢測(cè)的回收率水平

以上結(jié)果通過(guò)檢測(cè)上述樣品中不同濃度的黃曲霉毒素 M1（表1）和參考物質(zhì)（圖3）得到證實(shí)。2017年在AIA 環(huán)測(cè)試中（注 AIA:意大利育種協(xié)會(huì)，管理意大利所有肉產(chǎn)品和奶產(chǎn)品的生產(chǎn)）對(duì)乳制品中黃曲霉毒素M1檢測(cè)，Bio-Shield M1 ELISA試劑盒（61號(hào)）和Symmetric M1側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l（98號(hào)）分別在99個(gè)參加者中排名第2（Z分?jǐn)?shù)：0.04）和第5（Z分?jǐn)?shù)：0.2）（表2）（圖4）。在5名側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l參加者中，Symmetric M1 排名第1（圖5）。

圖3: ELISA 和側(cè)向?qū)游鰴z測(cè)參考物質(zhì)的回收率水平

表 1: 相對(duì)偏差(%) (ELISA結(jié)果(ppt)/側(cè)向?qū)游鼋Y(jié)果(ppt)

表2: 2017年9月乳品中黃曲霉毒素M1 AIA 環(huán)測(cè)試結(jié)果RT M1 260917

圖4: 2017年9月乳品中黃曲霉毒素M1 AIA 環(huán)測(cè)試RT M1 260917 所有參加者 Z-分?jǐn)?shù)結(jié)果

圖5: 2017年9月黃曲霉毒素M1 AIA環(huán)測(cè)試RT M1 260917中側(cè)向?qū)游鰠⒓诱?Z-分?jǐn)?shù)

高親和力抗體和高級(jí)定量系統(tǒng)的結(jié)合有助于獲得較大范圍的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)掃描設(shè)備的結(jié)果，ELISA 和側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l的曲線圖以及回收率水平幾乎相同。

5. 結(jié)論

??? 該創(chuàng)新的對(duì)稱型側(cè)向?qū)游龇椒ㄊ菣z測(cè)乳制品中黃曲霉毒素 M1快速定量檢測(cè)方法中最準(zhǔn)確的工具，其結(jié)果可與定量 ELISA 結(jié)果相媲美。

2018年8月 Bio-Shield M1 ES試劑盒及Symmetric M1定量試紙條通過(guò)ILVO驗(yàn)證（ILVO: Flanders research institute for agriculture, fisheries and food. Technology and Food Science unit, Belgium.比利時(shí)弗拉芒農(nóng)業(yè)漁業(yè)和食品研究所，被譽(yù)為歐洲的AOAC）。

ILVO 研究報(bào)告

S-Flow 分析系統(tǒng)